PEWARNAAN GRAM

Pewarnaan Gram

Pewarnaan Gram adalah pewarnaan diferensial yang sangat berguna dan paling banyak digunakan dalam laboratorium mikrobiologi, karena merupakan tahapan penting dalam langkah awal identifikasi. Pewarnaan ini didasarkan pada tebal atau tipisnya lapisan peptidoglikan di dinding sel dan banyak sedikitnya lapisan lemak pada membran sel bakteri. Jenis bakteri berdasarkan pewarnaan gram dibagi menjadi dua yaitu gram positif dan gram negatif. Bakteri gram positif memiliki dinding sel yang tebal dan membran sel selapis. Sedangkan baktri gram negatif mempunyai dinding sel tipis yang berada di antara dua lapis membran sel (Manurung, 2010).

Penambahan violet pada bakteri. Kristal violet merupakan reagen yang berwarna ungu. Kristal violet ini merupakan pewarna primer (utama) yang akan memberi warna pada mikroorganisme target. Kristal violet bersifat basa sehingga mampu berikatan dengan sel mikroorganisme yang bersifat asam. Dengan perlakuan seperti itu, sel mikroorganisme yang transparan akan terlihat berwarna (ungu). Pemberian kristal violet pada bakteri gram positif akan meninggalkan warna ungu muda. Perbedaan respon terhadap mekanisme pewarnaan gram pada bakteri adalah didasarkan pada struktur dan komposisi dinding sel bakteri. Bakteri gram positif mengandung protein dan gram negatif mengandung lemak dalam persentasi lebih tinggi dan dinding selnya tipis. Kristal violet yang diteteskan didiamkan selama 1 menit bertujuan agar cat atau pewarna ini dapat melekat sempurna pada dinding sel bakteri.

Pewarnaan Gram ini pertama kali dikembangkan oleh seorang ahli histologik Christian Gram (1884). Dengan pewarnaan Gram, bakteri-bakteri dapat dibagi atas 2 golongan yaitu Gram positif dan Gram negatif. Gram positif warnanya violet (ungu) karena mengikat zat warna utama “kristal violet”. Sedangkan Gram negatif berwarna merah jambu karena melepaskan zat warna utama dan menangkap zat warna penutup ”fuchsin”. Prinsip atau pokok-pokok pewarnaan Gram meliputi 4 tingkatan yaitu :

1.    Pewarnaan dengan zat warna utama (kristal gentian violet yang warnanya violet).

2.   Merekatkan (mengintensifkan) dengan suatu larutan mordant, yaitu larutan lugol (J-KJ).

3.    Menambahkan zat decolorisasi (bahan peluntur) misalnya alkohol atau alkohol-asam.

4.   Pemberian zat penutup (counter stain), misalnya : larutan fuchsin, safranin, dll.

Pulasan menurut Gram mempunyai banyak modifikasi, sebaiknya pakailah salah satu cara saja diantara yang banyak. Kesalahan biasanya terdapat pada ”overstaining” dan ”overdecolozing”, yaitu terlalu lama memberikan zat-zat warna atau pancucian dengan alkohol. Akibatnya Gram-positif dapat menjadi Gram negatif. Teknik mewarnai hendaknya dikontrol juga dengan melakukan pemulasan terhadap bakteri yang telah diketahui Gramnya. Larutan-larutan zat warna yang digunakan senantiasa diperiksa, apakah sudah terdapat kristal-kristal atau kotoran-kotoran lainnya. Gunakanlah selalu larutan-larutan zat warna yang disaring dengan kertas saring.

  Macam-macam pewarnaan yang di lakukan dalam praktikum tentang cara-cara pewarnaan antara lain :

a.              Pewarnaan sederhana

Tujuan dari pewarnaan sederhana adalah mengidentifikasi morfologi sel bakteri dengan menggunakan zat warna tunggal. Prinsipnya yaitu  pewarnaan ini hanya menggunakan satu macam zat warna saja. Sebelum zat warna difiksasi terlebih dahulu pewarnaan ini dipakai untuk melihat bentuk-bentuk bakteri. Zat warna yang di gunakan adalah Methylen blue, Crystal violet, basic fuchin atau safranin. Fungsi zat warna: Crystal violet merupakan pewarna primer (utama) yang akan memberiwarna mikrioorganisme target. Crystal violet bersifat basa sehingga mampu berikatan dengan sel mikroorganisme yang bersifat asam (Sutedjo, 1991).

b.             Pewarnaan Negatif

Tujuan dari pewarnaan negatif adalah untuk mengetahui bentuk mikroba dengan pewarnaan-pewarnaan tidak langsung. Prinsip pewarnaan negatif adalah cara pengamatan mikrobiologi yang dapat di lakukan untuk membedakan spesies kecil dan cairan optiknya. Pewarnaan ini merupakan pewarnaan yang di gunakan untuk melihat secara tidak langsung, karena yang diwarnai adalah latar belakangnya, sedangkan bakterinya sendiri tidak mengalami pewarnaan. Pada pewarnaan ini tidak di lakukan fiksasi karena itu dapat digunakan untuk melihat bentuk-bentuk sel yang sesungguhnya dan untuk menentukan ukuran bakteri, karena bakteri praktis tidak mengalami perubahan. Berbeda dengan pewarnaan lain, pewarnaan negatif memungkinkan bakteri terlihat transparan dan tampak jelas. Fungsi zat warna: Safranin merupakan pewarnaan tandingan atau pewarna skunder, zat ini berfungsi untuk mewarnai sel-sel yang telah kehilangan warna utama dengan kata lain memberikan warna pada bakteri non target (Pelczar, 2007).

c.              Pewarnaan Gram

Tujuan dari pewarnaan gram adalah untuk melakukan pengamatan morfologi bakteri dengan pewarnaan diferensial. Prinsip pewarnaan gram termasuk pewarnaan diferensial (untuk membedakan) karna dapat membedakan bakteri-bakteri yang bersifat gram negatif dan positif. Pewarnaan ini ditemukan pertama kali pada tahun 1884 oleh Criestian Gram.

Bakteri garam positif  ialah bakteri yang mengikat warna utama (crystal violet) dengan kuat sehingga tidak dapat di lunturkan oleh peluntur dan tidak diwarnai lagi oleh zat warna lawan (safranin) pada mikroskop sel-sel bakteri tampak berwarna ungu.

Bakteri gram negatif  ialah bakteri yang mempuyai daya mengikat zat warna utama tidak kuat sehingga dapat dilunturkan oleh  peluntur dan dapat diwarnai oleh zat warna lawan (safranin) pada pengamatan mikroskop sel-sel bakteri tampak berwarna merah.

Fungsi zat warna:

Crystal violet yang berfungsi membentuk ikatan mg-Ribonucleid acid pada membran/dinding sel bakteri sehingga membentuk kompleks mg-Ribonucleid acid- crystal violet. Kompleks ini merupakan senyawa yang tidak luntur dengan alkohol.

Lugol’s ladin yang berfungsi sebagai penguat ikatan pada kompleks mg-Ribonuclead acid.

Alkohol 95% berfungsi mencuci lemak pada dinding sel bakteri.

Safranin berfungsi sebagai zar warna tandingan (lawan) luruh nya kompleks mg-Ribonucleid acid- crystal violet dari dinding sel bakteri gram negatif (Pelczar, 2007).

Fiksasi adalah proses yang dilakukan untuk pewarnaan yang dapat berpenetrasi kedalam endospora.

Yang membuat praktikum kurang akurat disebabkan oleh faktor kesalahan adapun faktor kesalahan sebagai berikut: Fiksasi yang kurang tepat dapat mengakibatkan bakteri mati, Pemberian zat warna yang terlalu berlebihan dapat memperlambat pengeringan tanpa fiksasi dan memperlambat proses pengamatan, Sentuhan atau geseran pada preparat yang telah berisi bakteri dapat menganggu struktur bakteri.

GAMBAR DATA PENGAMATAN