Pewarnaan
Gram
Pewarnaan
Gram adalah pewarnaan diferensial yang sangat berguna dan paling banyak
digunakan dalam laboratorium mikrobiologi, karena merupakan tahapan penting
dalam langkah awal identifikasi. Pewarnaan ini didasarkan pada tebal atau tipisnya
lapisan peptidoglikan di dinding sel dan banyak sedikitnya lapisan lemak pada
membran sel bakteri. Jenis bakteri berdasarkan pewarnaan gram dibagi menjadi
dua yaitu gram positif dan gram negatif. Bakteri gram positif memiliki dinding
sel yang tebal dan membran sel selapis. Sedangkan baktri gram negatif mempunyai
dinding sel tipis yang berada di antara dua lapis membran sel (Manurung, 2010).
Penambahan
violet pada bakteri. Kristal violet merupakan reagen yang berwarna ungu.
Kristal violet ini merupakan pewarna primer (utama) yang akan memberi warna
pada mikroorganisme target. Kristal violet bersifat basa sehingga mampu
berikatan dengan sel mikroorganisme yang bersifat asam. Dengan perlakuan
seperti itu, sel mikroorganisme yang transparan akan terlihat berwarna (ungu).
Pemberian kristal violet pada bakteri gram positif akan meninggalkan warna ungu
muda. Perbedaan respon terhadap mekanisme pewarnaan gram pada bakteri adalah
didasarkan pada struktur dan komposisi dinding sel bakteri. Bakteri gram positif
mengandung protein dan gram negatif mengandung lemak dalam persentasi lebih
tinggi dan dinding selnya tipis. Kristal violet yang diteteskan didiamkan
selama 1 menit bertujuan agar cat atau pewarna ini dapat melekat
sempurna pada dinding sel bakteri.
Pewarnaan Gram ini pertama kali dikembangkan oleh seorang ahli histologik
Christian Gram (1884). Dengan pewarnaan Gram, bakteri-bakteri dapat dibagi atas
2 golongan yaitu Gram positif dan Gram negatif. Gram positif warnanya violet (ungu) karena mengikat zat warna utama
“kristal violet”. Sedangkan Gram negatif berwarna merah jambu karena
melepaskan zat warna utama dan menangkap zat warna penutup ”fuchsin”. Prinsip
atau pokok-pokok pewarnaan Gram meliputi 4 tingkatan yaitu :
1. Pewarnaan dengan zat warna utama (kristal gentian
violet yang warnanya violet).
2. Merekatkan (mengintensifkan) dengan suatu larutan
mordant, yaitu larutan lugol (J-KJ).
3. Menambahkan zat decolorisasi (bahan peluntur) misalnya
alkohol atau alkohol-asam.
4. Pemberian zat penutup (counter stain), misalnya :
larutan fuchsin, safranin, dll.
Pulasan menurut Gram mempunyai banyak modifikasi, sebaiknya pakailah salah
satu cara saja diantara yang banyak. Kesalahan biasanya terdapat pada
”overstaining” dan ”overdecolozing”, yaitu terlalu lama memberikan zat-zat
warna atau pancucian dengan alkohol. Akibatnya Gram-positif dapat menjadi Gram
negatif. Teknik mewarnai hendaknya dikontrol juga dengan melakukan pemulasan
terhadap bakteri yang telah diketahui Gramnya. Larutan-larutan zat warna yang
digunakan senantiasa diperiksa, apakah sudah terdapat kristal-kristal atau
kotoran-kotoran lainnya. Gunakanlah selalu larutan-larutan zat warna yang
disaring dengan kertas saring.
Macam-macam pewarnaan yang di
lakukan dalam praktikum tentang cara-cara pewarnaan antara lain :
a. Pewarnaan
sederhana
Tujuan dari
pewarnaan sederhana adalah mengidentifikasi morfologi sel bakteri dengan
menggunakan zat warna tunggal. Prinsipnya yaitu pewarnaan ini hanya
menggunakan satu macam zat warna saja. Sebelum zat warna difiksasi terlebih
dahulu pewarnaan ini dipakai untuk melihat bentuk-bentuk bakteri. Zat warna
yang di gunakan adalah Methylen blue, Crystal violet, basic fuchin atau
safranin. Fungsi zat warna: Crystal violet merupakan pewarna primer (utama) yang
akan memberiwarna mikrioorganisme target. Crystal violet bersifat basa sehingga
mampu berikatan dengan sel mikroorganisme yang bersifat asam (Sutedjo,
1991).
b. Pewarnaan
Negatif
Tujuan dari
pewarnaan negatif adalah untuk mengetahui bentuk mikroba dengan
pewarnaan-pewarnaan tidak langsung. Prinsip pewarnaan negatif adalah cara
pengamatan mikrobiologi yang dapat di lakukan untuk membedakan spesies kecil
dan cairan optiknya. Pewarnaan ini merupakan pewarnaan yang di gunakan untuk melihat
secara tidak langsung, karena yang diwarnai adalah latar belakangnya, sedangkan
bakterinya sendiri tidak mengalami pewarnaan. Pada pewarnaan ini tidak di
lakukan fiksasi karena itu dapat digunakan untuk melihat bentuk-bentuk sel yang
sesungguhnya dan untuk menentukan ukuran bakteri, karena bakteri praktis tidak
mengalami perubahan. Berbeda dengan pewarnaan lain, pewarnaan negatif
memungkinkan bakteri terlihat transparan dan tampak jelas. Fungsi zat
warna: Safranin merupakan pewarnaan tandingan atau pewarna skunder, zat ini
berfungsi untuk mewarnai sel-sel yang telah kehilangan warna utama dengan kata
lain memberikan warna pada bakteri non target (Pelczar, 2007).
c. Pewarnaan
Gram
Tujuan dari
pewarnaan gram adalah untuk melakukan pengamatan morfologi bakteri dengan
pewarnaan diferensial. Prinsip pewarnaan gram termasuk pewarnaan
diferensial (untuk membedakan) karna dapat membedakan bakteri-bakteri yang
bersifat gram negatif dan positif. Pewarnaan ini ditemukan pertama kali pada
tahun 1884 oleh Criestian Gram.
Bakteri
garam positif ialah bakteri yang mengikat warna utama (crystal violet)
dengan kuat sehingga tidak dapat di lunturkan oleh peluntur dan tidak diwarnai
lagi oleh zat warna lawan (safranin) pada mikroskop sel-sel bakteri tampak
berwarna ungu.
Bakteri gram
negatif ialah bakteri yang mempuyai daya mengikat zat warna utama tidak
kuat sehingga dapat dilunturkan oleh peluntur dan dapat diwarnai oleh zat
warna lawan (safranin) pada pengamatan mikroskop sel-sel bakteri tampak
berwarna merah.
Fungsi zat
warna:
Crystal
violet yang berfungsi membentuk ikatan mg-Ribonucleid acid pada membran/dinding
sel bakteri sehingga membentuk kompleks mg-Ribonucleid acid- crystal violet.
Kompleks ini merupakan senyawa yang tidak luntur dengan alkohol.
Lugol’s
ladin yang berfungsi sebagai penguat ikatan pada kompleks mg-Ribonuclead acid.
Alkohol 95%
berfungsi mencuci lemak pada dinding sel bakteri.
Safranin
berfungsi sebagai zar warna tandingan (lawan) luruh nya kompleks mg-Ribonucleid
acid- crystal violet dari dinding sel bakteri gram negatif (Pelczar,
2007).
Fiksasi
adalah proses yang dilakukan untuk pewarnaan yang dapat berpenetrasi kedalam
endospora.
Yang membuat
praktikum kurang akurat disebabkan oleh faktor kesalahan adapun faktor
kesalahan sebagai berikut: Fiksasi yang kurang tepat dapat mengakibatkan
bakteri mati, Pemberian zat warna yang terlalu berlebihan dapat
memperlambat pengeringan tanpa fiksasi dan memperlambat proses
pengamatan, Sentuhan atau geseran pada preparat yang telah berisi bakteri
dapat menganggu struktur bakteri.
GAMBAR DATA PENGAMATAN
